서 론

수소는 청정성과 높은 에너지 수율을 갖춘 에너지 운반체로 널리 연구되어 왔으며, 현재 대부분 고온·고압의 메탄 수증기 개질(steam methane reforming)을 통해 생산된다. 이에 비해 생물학적 수소 생산은 보다 친환경적인 대안으로 평가된다(Agyekum et al., 2022). 특히 혐기성 발효(암발효)를 이용한 방법은 광 의존적 방법에 비해 생산속도와 수율이 높고 반응기 설계가 단순하며, 다양한 기질을 활용하면서 휘발성 지방산(volatile fatty acids, VFAs)·알코올 등 부가가치 대사산물을 동시에 생산할 수 있어 가장 효율적이고 경제적인 바이오수소 생산 방식으로 평가된다(Agyekum et al., 2022; Albuquerque et al., 2024; Xiao et al., 2025).

그러나 혐기성 발효를 통한 수소 생산은 프로피온산(propionic acid, HPr)의 과다 생성에 취약하다. 수소 생산은 프로피온산 생성을 수반하지 않는 것으로 알려져 있음에도 불구하고(Hallenbeck and Ghosh, 2009; Hanaki et al., 1994), 메탄 및 수소 생산 과정에서 프로피온산의 과다 생성이 빈번히 보고되어 왔는데, 이는 프로피온산의 아세트산화(acetogenesis) 속도가 부티르산(butyric acid, HBu)이나 에탄올(ethanol, EtOH) 등 다른 대사산물에 비해 느리기 때문이다(Hanaki et al., 1994; Qu et al., 2022). 다음과 같이 수소를 소모하는 경로에 해당하는 프로피온산 축적 사례가 다수 보고되어 있다

C₆H₁₂O₆ + 2H₂→2H₂O + 2CH₃CH₂COOH

수소 분압을 낮추기 위한 방법으로 질소·아르곤·헬륨 등 비활성 기체 주입(purging), 반응기 상부 공간(headspace)의 바이오가스 흡인, 교반 속도 증가 등이 제시되어 왔으며, 순수 배양에서는 대조군 대비 수소 생산량이 두 배까지 증가한 사례도 보고되었다(Tanisho et al., 1998; Oh et al., 2002; Mandal et al., 2006). 그러나 정제된 비활성 기체를 별도로 주입하는 방식은 추가 비용을 수반한다. 이에 비해 반응기에서 생산된 바이오가스(주로 CO₂)를 반응기 내로 재순환시키는 방식은 가스 전달계수를 높여 용존 수소를 기상으로 전환시키면서도 외부 가스 공급이 불필요하다는 점에서 경제적 대안이 될 수 있으며, 실제로 자가 발생 바이오가스를 연속 수소 발효에 재순환시키는 방식이 제시된 바 있다(Bakonyi et al., 2017; Nualsri et al., 2017; Xiao et al., 2025). 다만 CO₂는 수용해도가 비교적 높아(25°C, 100 kPa에서 1.45 g/L) 분압이 높을 경우 혐기성 소화의 효소적 메탄 생성을 저해할 수 있으나(Hansson and Molin, 1981), 이러한 저해는 낮은 pH 조건에서 CO₂ 용해도가 감소하므로 크게 완화될 수 있다.

프로피온산 축적은 프로피온산 생성균과 부티르산 생성균 간의 개체군 동태 및 경쟁 관계에 의해 조절된다(Ban et al., 2024). Willquist 등(2009)은 pH 6.5, 70°C 조건에서 Caldicellulosiruptor saccharolyticus를 대상으로 N₂ 및 CO₂ 스파징을 비교한 결과, CO₂ 스파징에 따른 낮은 pH와 높은 삼투압이 수소 생산성을 감소시켰으나 수소 수율에는 영향을 미치지 않음을 보고하였다. Clostridium sporogenes의 경우, 미생물의 생장 수율은 중성 pH 조건에서 CO₂ 분압보다는 배지 종류에 따라 변화하는 것으로 나타났다(Dixon et al., 1987). 그러나 낮은 운전 pH 조건에서 혼합 미생물 군집을 대상으로 수행된 연구는 거의 없으며, 이러한 조건은 CO₂ 용해도를 낮추어 앞서 언급된 한계를 극복할 수 있는 가능성을 제공한다.

Won and Lau(2011)는 본 연구와 동일한 anaerobic sequencing batch reactor(ASBR) 시스템 및 종균을 사용하여 바이오수소 생산을 위한 운전 체계를 선행 연구를 통해 정립한 바 있다. 동 연구에서는 프로피온산/초산(HPr/HAc) 비율과 에탄올/초산(EtOH/HAc) 비율이라는 두 가지 핵심 대사산물 비율을 수소 생산성의 지표로 제안하였다.

본 연구는 위 선행 연구의 토대 위에서, 가축분뇨 유래 폐수를 기질로 하는 연속 ASBR 운전 과정에서 발생하는 특정 교란 시나리오, 즉 프로피온산의 저해성 축적 현상을 중점적으로 다룬다. 이전의 연구가 수소 생산성 저하와 관련된 대사 지표를 규명한 데 비해, 본 연구는 생산성 억제의 원인으로서 프로피온산 축적을 식별하고, 시스템 회복을 위한 실용적 전략으로 바이오가스 재순환 방식을 제안하고자 수행되었다. 따라서 본 연구의 목적은 (1) 연속 ASBR 운전 조건에서 프로피온산에 의한 저해의 발생 조건을 규명하고, (2) CO₂가 풍부한 바이오가스의 간헐적 재순환이 외부 가스 보충없이 수소 생산성을 회복시킬 수 있는지 평가하는 데 있다.

재료 및 방법

1. 종균 슬러지 및 기질

종균 슬러지는 캐나다 브리티시컬럼비아대학교(University of British Columbia) 토목공학과에서 운영하는 생물학적 영양염류 제거 시범 시설로부터 채취하였다. 이후 본 슬러지는 자당이 풍부한 합성 폐수를 기질로 약 3년간 연속적으로 사용되어 온 종균으로, 메탄 생성균 제거를 위한 열충격·산·알칼리 등의 전처리는 수행하지 않았다. 슬러지 농도는 각 실험 운전 개시 시점에 혼합휘발성부유고형물(mixed liquor volatile suspended solids, MLVSS) 농도를 5,500 mg/L로 조정하였다. 이는 Won and Lau(2011)에서 보고된 초기 MLVSS 농도(11,000 mg/L 이상)보다 낮은 수준으로, 미생물 군집이 이미 낮은 pH 발효를 통한 수소 생산 조건에 순응이 완료된 장기간의 연속 운전 단계임을 반영한다.

Ince 등(2001)은 양조장 폐수를 대상으로 C:N:P 비율 400:5:1의 합성 기질을 사용한 바 있으며, Yilmazel and Duran(2021)은 소 분뇨를 직접 생물학적 수소생산에 적용한 바가 있다. 가축분뇨 폐수는 일반적으로 양조장 폐수보다 질소 및 인 함량이 높기 때문에 본 연구에서는 자당을 주된 탄소원으로 하고 탄소 대비 질소·인 비율을 높인 합성 가축분뇨 폐수를 제조하였다. 처리의 편의를 위해 합성 폐수에는 미생물 활성을 증진시키기 위한 탄소원을 추가 보강하였으며, 폐수에 대한 멸균 처리는 수행하지 않았으나 필수 무기 영양성분은 별도로 첨가하였다. 자당(10.7 g COD/L)에 NH₄Cl, K₂HPO₄, KH₂PO₄를 첨가하여 COD:N :P를 200:5:1로 조정하였다. 황은 필수 영양소이나 과잉 황산염은 황산염환원균(SRB)의 활성을 촉진하여 수소 생산균과 경쟁하고 H₂S 독성을 유발할 수 있으므로(Qu et al., 2022), 미량영양소로 공급된 황산염(ZnSO₄, MnSO₄· 4H₂O, CuSO₄)을 포함한 총 황이 COD:N:P:S = 200:5:1: 0.4가 되도록 K₂SO₄를 보충하여 공급하였다. 그 외 다량 및 미량 영양성분은 다음과 같이 공급하였다: 10 mg/L MgCl₂, 1 mg/L NiCl₂, 181 mg/L FeCl₂, 10 mg/L CaCl₂, 1 mg/L ZnSO₄, 0.5 mg/L Na₂MoO₄·H₂O, 1 mg/L MnSO₄· 4H₂O, 5 mg/L CuSO₄.

2. 실험 장치 및 운전 조건

실험실 규모의 생물반응기(New Brunswick Scientific, BioFlo 3000 fermentor 모델, Edison, NJ, USA)를 사용하였으며, 유효 부피는 6 L였다. 본 반응기는 액상 및 기상의 시료 채취 포트, 온도 및 pH 자동 제어, 모니터링 기능 등 다양한 헤드 유닛이 장착되어 있다. 운전 방식으로는 혐기성 연속회분식 반응기(ASBR)를 채택하였다(Dague et al., 1992). 운전 단계는 “주입(feed) → 반응(react) → 침전(settle) → 상등액 배출(decant)”의 순서로 구성하였다. HRT는 1일로 유지하였고 1주기는 8시간으로 설정하였으며, OLR은 10.7 kg/m³/d로 일정하게 유지하였다. pH는 3M NaOH 및 3M HCl을 이용하여 4.5로 자동 제어하였다.

본 운전 조건에서는 메탄 생성이 억제되어 생성 바이오가스가 사실상 수소와 CO₂로 구성되므로, 바이오가스 내 CO₂ 함량은 수소 함량의 역지표로 활용할 수 있다. 즉 CO₂ 함량이 90%를 초과한다는 것은 수소 함량이 약 10% 미만으로 감소하여 수소 생산이 억제되었음을 의미한다. 본 연구에서는 이러한 억제가 일시적 변동이 아니라 지속적인 저해 상태임을 확인하기 위해, CO₂ 함량이 90%를 초과하는 상태가 1주일간 지속되는 시점을 재순환 개시 기준으로 설정하였다. 이 기준은 프로피온산 저해의 대사 지표(HPr/HAc > 1.0, EtOH/HAc < 1.25)가 시스템 교란을 나타내는 시기와도 부합한다(Won and Lau, 2011). 기준 충족 시 생산된 바이오가스를 포집한 후 펌프를 이용하여 반응기 내로 재주입하였다. 재순환된 바이오가스의 부피와 유량은 표 1에 제시하였다. 순환은 지정된 일자의 각 주기에서 “반응(react)” 단계 시작 시점에 18–31분간 수행하였다.

3. 분석 방법

발효 과정에서 생성된 바이오가스는 두 채널 열전도도 검출기(thermal conductivity detector, TCD)를 장착한 가스크로마토그래프(GC, Varian Inc., CA, USA, CP-3800 모델)를 이용하여 측정하였다. 수소 분석에는 1.0 m × 3.2 mm Hayesep Q(80/100 mesh) 및 1.0 m × 3.2 mm Molesieve 5A(60/80 mesh) 컬럼을 사용하였으며, 운반가스로는 아르곤을 사용하였다. 휘발성 지방산(HAc, HPr, HBu) 및 알코올(에탄올, 부탄올)의 분석은 화염이온화 검출기(flame ionization detector, FID)를 사용하여 위와 동일한 방법으로 수행하였으며, 메탄올을 내부 표준물질로 사용하였다. COD, 총 고형물(total solids, TS), 총 휘발성 고형물(total volatile solids, TVS), 혼합액 부유고형물(mixed liquor suspended solids, MLSS), MLVSS 및 알칼리도는 표준 시험법(APHA, 2005)에 따라 측정하였으며, 모든 시료는 3반복으로 측정하여 제시하였다.

결 과

1. 수소생산력 저해와 바이오가스 재순환

수소 생산율은 0.83±0.20 L H₂/L_Reactor/d 수준으로 약 1개월간 비교적 안정적으로 유지되었다. 그러나 운전 34일째 HPr/HAc 비율이 1.0을 초과하면서 바이오가스 내 수소 함량이 변동하기 시작하였고, 이 시점에 프로피온산 농도는 약 10mM 이상으로 증가하기 시작하였다(Figure 1). 운전 54일째에는 수소 생산성이 급격히 감소하여 생성된 바이오가스가 거의 전적으로 CO₂로 구성되었다. 바이오가스 내에서 수소가 거의 검출되지 않은 기간 동안 프로피온산의 최대 생성은 수소 생산성을 현저히 저해하였다. 운전 62일째, 바이오가스가 주로 CO₂로 구성된 시점에 각 주기의 반응 단계 개시 직후 바이오가스를 반응기 내로 재주입하였다. 그 결과 바이오가스 조성 중 수소 함량(%)이 첨두 형태로 나타나며 수소 생산성이 다시 활성화되었다. 프로피온산 농도는 감소하였고, HPr/HAc 비율은 81일째부터 0.2 미만으로 떨어졌다. 6회에 걸친 바이오가스 순환 이후 에탄올 생성이 증가하였고, 수소함량이 급격히 감소하기 시작하는 51일 이전의 바이오가스 내 수소함량은 60.5±7.3%에서 76.4±4.7%로 약 26% 상승하였으며, 평균 수소 생산성은 초기 단계(운전 16–33일) 수준을 상회하는 0.8~1.2(평균 1.04±0.21) L H₂/L_Reactor/d, 약 25% 수준으로 회복되었다. 아세트산 생성은 86일째 50mM에서 정점에 도달하였다.

Figure 1.

Recovery of hydrogen productivity by circulating produced biogas.
*EtOH, ethanol; HAc, acetic acid; HPr, propionic acid; HBu, butyric acid; HPR, hydrogen production rate; The dotted lines indicate when biogas circulation was conducted.

바이오가스 재순환 이전에는 HPr/HAc 비율이 약 0.8(1.0에 근접) 이상으로 증가하면서 수소 함량이 감소하였고, HPr/HAc 비율이 약 1.5에 이르자 추가적인 수소 생산이 관찰되지 않았다. 6주기에 걸친 바이오가스 재순환 기간에는 HPr/HAc 비율이 1.5 이상이었음에도 불구하고 50% 이상의 수소 함량이 관찰되었다. 이는 바이오가스 재순환이 프로피온산 생성을 억제함을 시사하는 결과이다. 바이오가스 재순환이 종료된 이후에는 바이오가스 내 수소 함량과 수소 생산율이 재순환 이전 대비 각각 약 26%, 25% 증가하는 결과를 나타내었다(Figure 1).

2. 수소생산력과 대사물질과의 관계

Figure 1에 나타난 바와 같이 프로피온산 축적의 초기 단계에서는 에탄올 농도가 비교적 안정적으로 유지되었으나, 운전 54일에서 61일에 걸쳐 수소 생산성이 악화되는 동안 EtOH/HAc 비율은 점진적으로 감소하였다. 이 기간 동안 EtOH/HAc 비율은 1.25 미만으로 떨어졌으며, 1.25라는 값은 Won and Lau(2011)가 동일한 ASBR 시스템에서 에탄올형 발효 조건의 지속적 수소 생산을 위한 최소 임계값으로 제시한 수치이다. 바이오가스 재순환을 개시한 시점(운전 62일 이후)부터는 아세트산 생성의 회복과 함께 에탄올 생성도 점진적으로 증가하였으며, 약 81일경에는 EtOH/HAc 비율이 1.25 임계값을 상회하는 수준으로 회복되었다. 본 관찰은 EtOH/HAc 비율이 시스템 교란의 임박을 알리는 조기 지표로서 유용함을 다시 한 번 입증하는 것으로 나타났다.

Figure 2는 HPr/HAc 비율 변화에 따른 바이오가스 내 수소 함량을 나타낸 것으로 HPr/HAc 비는 HPR의 저하와 상반되는 추세를 보여주고 있으며, 이를 바이오가스 내 수소 농도와 대응시킨 결과가 나타나 있다. 바이오가스 재순환 이후에는 바이오가스 내 수소함량(▲)이 80%에 육박하는 현상이 나타났으며, HPr/HAc 1.5 이상의 수준에서는 바이오가스 내 수소가 20% 이내로 매우 저조한 생산력을 보여주었다. 바이오가스의 재순환 중에는 HPr/HAc 약 1.8 수준에서도 수소함량이 최대 50%까지 높게 나타났으나, 이것은 바이오가스 재순환과정에서의 이상점(oval 표시)이라고 판단된다.

Figure 2.

Hydrogen content in biogas with propionic/acetic acid (HPr/HAc) ratio.

프로피온산 우세 발효에서 EtOH/HAc 균형 발효로의 이러한 대사 전환은 낮은 운전 pH 조건에서 에탄올형 발효가 안정적인 NAD⁺/NADH 평형과 연관되어 있다는 Won and Lau(2011)의 관찰과 일치한다. 실제로 에탄올형 발효에서 에탄올 생성과 수소 생성은 공통의 환원력인 NADH를 공유하며 세포 내 NAD⁺/NADH 평형에 따라 그 분배가 결정되는 것으로 보고되어 있어(Li et al., 2023), EtOH/HAc 비율이 대사 균형과 수소 생산성을 반영하는 지표로 기능한다는 본 연구의 관점을 뒷받침한다. 따라서 본 연구의 결과는 CO₂가 풍부한 바이오가스 재순환이 프로피온산 축적을 직접적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 효과적인 수소 생산에 필요한 대사 균형을 재정립하는 작용을 한다는 점을 시사하는 것으로 추측된다.

본 연구의 반응기는 pH 4.5에서 운전되었는데, 이는 동일 ASBR 시스템에서 pH 4.5와 HRT 30시간 조건이 최대 수소 생산율(3.04 L H₂/L_Reactor/d)와 수소 수율(2.16 mol H₂/mol hexose)을 산출함을 입증한 Won and Lau(2011)의 결과에 근거한 것이다. 낮은 pH 조건은 메탄 생성 활성을 억제할 뿐만 아니라 CO₂의 용해도도 감소시키는데, 이는 보다 높은 pH 조건에서 보고된 CO₂ 저해 효과(Willquist et al., 2009) 없이 효과적인 바이오가스 재순환을 가능하게 하는 핵심 요인이라고 볼 수 있다.

CO₂가 풍부한 바이오가스가 각 반응 단계 시작한 시점에 간헐적으로 재순환되었을 때, CO₂는 미생물 세포막을 자유롭게 투과할 수 있으며, 세포 외 pH가 4.5로 낮은 조건에서 CO₂의 액상 용해는 제한적이지만, 세포 내 환경은 중성 pH에 근접하므로 투과된 CO₂는 중탄산이온(HCO₃^-)으로 전환된다. 이러한 전환은 에너지적으로 덜 유리한 프로피온산 경로로부터 미생물 대사를 전환시킴으로써 프로피온산 축적을 억제하고 수소 생산성을 회복시키는 결과를 유도하는 것으로 예측된다.

고 찰

본 연구에서 채택한 ASBR 방식은 이러한 회복 전략에 적합한 운전 기반을 제공하였다. ASBR은 미생물 보유 능력이 우수하여 낮은 pH의 선택압 하에서도 순응된 군집을 안정적으로 유지할 수 있고, 유기물 부하율(OLR) 변동에 대한 공정 유연성이 높으며, 단일 반응조에서 반응과 침전을 모두 수행하여 연속적인 수소 생산을 구현할 수 있다(Dague et al., 1992). 특히 주기별 “반응” 단계 시작 시점에 바이오가스를 재주입하는 본 연구의 재순환 방식은 이러한 회분식 주기 구조에 용이하게 통합될 수 있다는 점에서, ASBR은 프로피온산 저해의 진단과 회복을 함께 다루기에 적합한 시스템이라 할 수 있다. 수소 생산 반응기는 비교적 낮은 pH 4.5, 일정한 HRT(1일) 및 OLR(10.7 kg/m³/일) 조건에서 운전되었다. 초기 약 1개월간 수소 생산율은 0.83±0.20 L H₂/L_Reactor/d일로 안정적으로 유지되었으나, 운전 34일째 HPr/HAc 비율이 1.0을 초과하면서 수소 함량이 변동하기 시작하였고, 54일째에는 바이오가스가 거의 전적으로 CO₂로 구성되며 수소 생산성이 붕괴되었다. 이 과정에서 EtOH/HAc 비율은 지속적 수소 생산의 임계값인 1.25(Won and Lau, 2011) 미만으로 감소하였다. 반대로 62일째부터 CO₂가 풍부한 바이오가스를 각 주기의 반응 단계 개시 시점에 재순환시키자 프로피온산 농도가 감소하고 HPr/HAc 비율이 0.2 미만으로 떨어졌으며, EtOH/HAc 비율은 81일경 1.25 임계값을 다시 상회하였고 수소 생산성이 회복되었다. 특히 재순환 기간에는 HPr/HAc 비율이 1.5 이상으로 높은 상태에서도 50% 이상의 수소 함량이 유지되어, 재순환이 프로피온산의 저해 효과 자체를 완화함을 시사하였다. 이처럼 HPr/HAc(>1.0)와 EtOH/HAc(<1.25)의 두 대사산물 비율은 시스템 교란의 임박을 알리는 신뢰성 있는 조기 진단 지표로 작용하였으며, 실제 연속 운전 조건에서 이들 지표의 진단적 가치를 재확인하였다.

프로피온산 축적의 기작은 다음과 같이 설명된다. 유기물·수리학적 과부하나 높은 수소 분압 조건에서는 NADH 의존성 효소인 NADH:ferredoxin 산화환원효소가 저해를 받아(60–100 Pa 수준의 낮은 수소 분압에서도 저해; Harper and Pohland, 1986) NADH가 ferredoxin으로 전자를 전달하지 못하고 세포 내에 축적된다. 그 결과 NADH가 수소 생성 경로를 통해 재산화되지 못하여 NAD⁺/NADH 비율이 저하되며, 세포는 이 균형을 회복하기 위해 NADH를 재산화시키는 우회(단락) 경로, 즉 프로피온산 생성 경로를 가동하게 되어 프로피온산이 축적된다(Ren et al., 1997; Dinopoulou et al., 1988). 즉 프로피온산 경로는 수소 생성이 저해된 조건에서 잉여 환원력(NADH)을 소비하는 전자 흡수원으로 작용하며, 이는 프로피온산 생성이 수소를 소모하는 경로라는 점과도 부합한다.

프로피온산이 다량 생성되는 동안 바이오가스 내 수소는 거의 관찰되지 않았으나, CO₂가 풍부한 바이오가스를 간헐적으로 재순환시키자 수소 생산성이 회복되고 에탄올 생성이 증가하였으며 프로피온산 생성은 억제되었다. Tanisho 등(1998)은 비활성 기체 폭기로 CO₂를 제거하였을 때 에탄올 농도가 변화하지 않았다고 보고하였는데, 이는 비활성 기체의 효과가 수소 분압을 낮추는 물리적 작용에 국한되기 때문으로 해석된다. 반면 본 연구에서 재순환된 기체는 CO₂가 풍부한 바이오가스로서 수소 분압을 희석하는 동시에 반응기 내 CO₂ 분압을 오히려 증가시킨다는 점에서 근본적으로 다르다. 실제로 CO₂ 스파징(sparging)을 적용한 선행 연구에서도 수소 수율 증가와 함께 n-부티르산·이소프로판올 등의 생성이 동반되어, CO₂가 단순한 수소 분압 조절을 넘어 탄소 대사 흐름을 재분배함을 시사한 바 있다(Kim et al., 2012). 따라서 본 연구에서 관찰된 에탄올 생성 증가는 단순한 수소 분압 저하가 아니라 재유입된 CO₂의 대사적 작용에 기인하는 것으로 추론될 수 있다(Lacoursiere et al., 1986).

Lacoursiere 등(1986)은 CO₂가 다양한 효소 반응을 통해 생리적 영향을 미치며, Escherichia coli를 사용한 경우 대사산물 생성 경로의 평형에 영향을 미칠 수 있다고 보고하였다. CO₂가 반응기 내로 순환될 경우 CO₂는 미생물 세포막을 자유롭게 투과하지만, pH가 4.5로 낮은 조건에서는 세포막 자체에는 잘 용해되지 않는다. 미생물의 세포 내 pH가 중성이므로 투과된 CO₂는 중탄산이온으로 전환되며, 이때 잔존 양성자는 양성자 펌프(ATP 분해효소)를 통해 세포 외부로 방출되고, 중탄산이온 또한 펌프를 통해 세포 외로 배출되거나 누출될 수 있다. 이 과정에서 미생물은 분자 포도당으로부터 4 ATP를 산출하는 아세트산 생성 경로를 선택함으로써 ATP 합성 증대에 집중할 수 있을 것으로 판단된다.

C₆H₁₂O₆ + 2H₂O → 4H₂ + 2CO₂ + 2CH₃COOH

한편 CO₂가 용해되면 재순환은 세포 외 환경의 산성화를 가중시키므로, 미생물은 상대적으로 산성 부산물을 많이 생성하는 아세트산-부티르산 결합 경로보다 산 부담이 작은 아세트산·에탄올 생성 경로를 선호하게 된다. 이러한 경로 전환은 NAD⁺/NADH 평형의 재정립과 맞물려 프로피온산 우세 발효에서 에탄올형 발효로의 대사 전환을 유도하는 것으로 판단된다. 이러한 회복이 가능했던 데에는 낮은 운전 pH가 핵심적인 역할을 하였다. 본 반응기는 동일 ASBR 시스템에서 pH 4.5·HRT 30시간이 최대 수소 생산율과 수율을 산출함을 입증한 Won and Lau(2011)에 근거하여 pH 4.5로 운전되었다. 낮은 pH는 중성 부근에서 최적 생장하는 메탄 생성 고세균에 불리한 선택적 환경을 조성하여, 별도의 열적·화학적 전처리 없이도 메탄 생성을 억제한다. 실제로 본 연구의 운전 조건에서 생산된 바이오가스 내 메탄 함량은 평균 0–1.3% 수준에 불과하여 메탄 생성이 효과적으로 억제되었음을 확인하였으며, 이는 적절한 운전 조건이 유지될 경우 비전처리 슬러지가 전처리 슬러지에 필적하는 수소 생산성을 보인다는 선행 보고와도 일치한다(Won and Lau, 2011; Ren and Gong, 2008; Zhu and Béland, 2006). 동시에 낮은 pH는 CO₂ 용해도를 감소시켜, 보다 높은 pH에서 보고된 CO₂ 저해(Willquist et al., 2009) 없이 CO₂가 풍부한 바이오가스의 재순환을 가능하게 하였다.

본 연구는 독립적으로 반복 운전된 복수의 반응기가 아니라 단일 ASBR의 장기 연속 운전에서 확보된 시계열 데이터에 기반하므로, 재순환 이전·기간·이후의 비교는 동일 반응기 내 시점 간 비교에 해당하며, 관찰된 향상치에 대한 엄밀한 통계적 유의성 검정과 효과 크기의 일반화에는 제약이 따른다. 하지만, 바이오가스 재순환이 총 6회기에 걸쳐 반복 적용되는 동안 프로피온산 감소, EtOH/HAc 비율 회복, 수소 생산성 회복이라는 동일한 경향이 일관되게 관찰되었다는 점은 결과의 내적 일관성을 뒷받침한다. 따라서 본 연구의 결과는 통계적으로 일반화된 정량적 효과라기보다, 저 pH 에탄올형 발효 조건에서 바이오가스 재순환이 프로피온산 저해를 완화하고 수소 생산성을 회복시킬 수 있음을 보여주는 실증적 근거로 해석하는 것이 타당하다. 아울러 이러한 효과는 CO₂ 용해도가 낮은 저 pH 에탄올형 발효 조건에 특화된 것으로, 다른 기질·pH· HRT 또는 반응기 형식에서도 동일하게 나타나는지는 추가 검증이 필요하다. 실제로 가스 스파징·바이오가스 재순환에 의한 개선 효과의 크기는 기질·반응기 구성·운전 pH에 따라 상이하게 보고된 바 있다(Dahiya et al., 2021). 향후, 세포 내 대사산물·보조인자(NAD⁺/NADH) 및 pH 프로파일의 직접 측정, 그리고 실험 개시 시점 종균의 이화학적 성상(MLSS, TS/TVS, 알칼리도 등) 측정을 통한 종균 특성의 정량적 제시가 필요할 것으로 사료된다.

결론적으로, ASBR 내 수소 생산성 억제의 주요 원인은 프로피온산의 과도한 축적으로 판단되었으며, 이는 선행연구에서 정립한 대사 임계값과 일치하는 결과이다. HPr/ HAc 비율이 1.0을 초과하고 EtOH/HAc 비율이 1.25 미만으로 떨어지는 두 지표는 시스템 교란의 신뢰성 있는 판단 지표로 작용하였으며, 실제 운전 조건에서 이들 대사산물 비율이 갖는 진단적 가치를 확인시켜 주었다. CO₂가 풍부한 바이오가스의 간헐적 재순환은 프로피온산 생성을 억제하고 EtOH/HAc 비율을 임계값 이상으로 회복시킴으로써 수소 생산성을 효과적으로 회복시켰다. 프로피온산 축적으로 수소 생산이 억제되기 이전의 정상(기준) 조건과 비교할 때, 바이오가스 재순환은 바이오가스 내 수소 함량을 26%, 수소 생산속도를 25%(L H₂/L_Reactor/d) 향상시켰다. 본 전략은 외부 가스 공급이 불필요하고 반응기 자체의 부산물 가스를 활용한다는 점에서, 실제 바이오수소 생산 시스템에 적용 가능한 비용 효율적이고 운전이 비교적 간단한 회복 방안으로서 의의를 지닌다고 할 수 있을 것이다.