서 론

생활수준의 향상 및 육류 위주의 식생활 양상의 변화로 축산 수요가 증가하게 되었고, 축산업은 큰 폭으로 성장하였다. 이로 인해 발생되는 축산폐기물의 증가는 저장 및 처리 과정에서 여러 종류의 환경오염을 야기시켰다. 특히 축산농가 주변의 악취 민원은 2011년 2,838건, 2018년 6,718건으로 지속적으로 증가하는 추세를 보이고 있으며 (Ministry of Environment, 2019; Anti-Corruption and Civil Rights Commission, 2018), 이는 사회적 갈등의 중심으로 인식되어 시급히 해결해야 할 과제이다. 축산악취 중 축종별로 가장 많은 비율은 차지하고 있는 것은 양돈 축사 유래 악취로 이는 밀집된 사육환경, 축사 내․외부 청결관리, 장기간 분뇨 저장 및 관리소홀에 의해 발생한다.

양돈 분뇨의 저장과정에서 발생하는 악취는 미생물에 의해 영양성분이 혐기성 상태에서 분해과정에서의 불완전 소화에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 단쇄지방산 (Short chain fatty acid), 이산화탄소 및 수소, 페놀류, 인돌류, 황화합물류, 암모니아 (NH₃), 아민 등이 생성된다 (Ministry of Environment, 2012; Jensen and Jørgensen, 1994; Aarnink, 1997).

축산 발생 악취 물질 중 암모니아는 가스 또는 증기의 흡입으로 사람과 동식물에게 피해를 주고 국내에서 발생하는 연간 41만톤의 먼지 중 약 7.5%는 축산활동에 의한 것이며 직접적인 미세먼지 배출뿐만 아니라 2차 미세먼지 발생 주요 전구체로 작용된다고 보고되고 있어 축산 발생 암모니아의 발생 저감을 위해 기술적 제도적 대책이 필요한 실정이다.

가축분뇨 내 질소는 사료를 통해 유입된 질소 성분이 체내에 30%가 저장되며, 나머지는 분 (20-50%), 뇨 (50-80%)로 배설되며, 뇨 내 질소는 약 97%가 요소 (Urea) 형태로 존재하게 된다. Urea는 가수분해나 호기성 발효를 거쳐 암모니아로 전환된다 (Kwon et al., 2000). Urea는 매우 안정된 물질이나, 요소분해효소 (Urease)와 결합 시 반감기가 20 ms 정도의 속도로 매우 빠르게 가수분해가 일어난다 (Callahan et al., 2005; Dai and Karring, 2014). 가수분해 과정에서 Urease는 Urea의 가수분해를 위해 2개의 Ni 이온을 끌어당겨 결합에 이용한다. 이 때 Urease 활성저해제 (Urease inhibitor)를 주입해 Urease의 활성을 억제시켜 축사 내 암모니아 발생 저감이 가능하다 (Sigurdarson et al., 2018; Amtul et al., 2002; Eitinger and Mandrand-Berthelot, 2000).

Acetohydroxamic acid (AHA)는 Urea와 구조가 비슷한 구조유사체로 의학적으로 만성 요소분해 요로 감염증의 보조치료제로 이용되고 있으나, 가축분뇨 암모니아 발생 저감 분야에서는 연구 수행실적이 없는 것으로 알려져 있다 (Krajewska et al., 2001).

따라서 본 연구는 AHA 주입하여 가축분뇨 내 Urea의 가수분해를 억제, 암모니아 발생 저감을 주요 목적으로 하였다. 실험은 합성요소를 이용해 축사의 일반적인 환경을 고려하여 Urea 농도 (500-4,000 mg Urea-N/L), AHA 농도 (500-4,000 mg AHA/L), pH (6-10), 온도 (15-35°C) 변화에 따른 암모니아 발생 저감 효율 평가를 수행하였다. 그리고 실제분뇨 내 AHA 적용을 통해 Urease 활성 저해 및 암모니아 발생 저감 효율 변화를 관찰하였다.

재료 및 방법

1. 사용 시약 및 실험 준비

(1) 사용 시약

본 실험을 위해 Urea (CH₄N₂O, 99%, Duksan, Korea), Urease (Jack bean urease, 2100 units/g, Fisher science, USA), AHA (C₂H₅ON₂, 98%, TCI, Japan)를 사용하였다. 각각의 Batch test는 실험 목적에 맞게 3 M KOH (Deajung, 93%, Korea), 3 M HCl (Daejung, 34-36%, Korea)를 제조 및 사용하였다. Buffer 용액으로 K₂HPO₄ (Daejung, 99%, Korea), KH₂PO₄ (Daejung, 99%, Korea)을 합성해 0.05 M PPB를 제조하여 사용하였다.

(2) Urease 억제 Batch test

양돈 축사 내 돈분뇨 슬러리 및 처리시설 내 슬러리의 NH₃ 농도는 약 3,000 mg/l로 보고되고 있다 (Ra et al., 2012). Urea 1 mole이 가수분해되어 2 mole의 NH₃로 전환되므로, Urea 농도의 기준농도를 1,500 mg/l로 설정하였다.

Batch test I은 Urea 농도 변화와 AHA 주입에 따른 Urease 활성 저해 효율 평가를 시행하였다. Serum bottle내 0.05 M PPB 50mL 주입 후, AHA 1,500 mg/l (Control : AHA 미주입), Urease 1,500 mg/l, Urea 750, 1,500, 3,000 mg/l를 각각 주입하였다. 온도 25°C, pH 7.0 ± 0.01으로 고정하였다.

Batch test II는 AHA 주입 농도에 따른 Urease 활성 저해 효율 평가를 실시하였다. Serum bottle에 0.05 M PPB 50 mL 주입하였고, AHA 농도를 750, 1,500, 3,000 mg/l (대조군 : AHA 미주입) 각각 주입 후, Urea 1,500 mg/l, Urease 1,500 mg/l를 주입하였으며, 온도 25°C, pH 7.0 ± 0.01로 고정하였다.

Batch test III에서는 pH 변화에 따른 Urease 활성 저해 비교 평가를 수행하였다. Serum bottle에 PPB 0.05 M 50 mL를 주입 후, AHA 1,500 mg/l (대조군 : AHA 미주입), Urea 1,500 mg/l, Urease 1,500 mg/l를 각각 주입 후, 온도는 25°C 고정하였고, pH를 6.0-10.0으로 조정 후 실험을 수행하였다.

Batch test IV는 온도 변화에 따른 Urease 활성 저해 효율을 비교하였다. Serum bottle에 PPB 0.05 M 50mL를 주입 후, AHA 1,500 mg/l (대조군 : AHA 미주입), Urea 1,500 mg/l, Urease 1,500 mg/l를 각각 주입 후, pH는 7.0 ± 0.01로 고정시켰으며, 온도를 15-35°C (15, 25, 35°C) 설정 후 진행하였다.

회분반응 V에서는 합성 분뇨 대신 실제 돼지분뇨 내 AHA 주입을 통한 Urease 활성 저해 효율 및 NH₃의 발생량 (mg/l) 저감 실험을 수행하였다. Serum bottle에 PPB 0.05 M 50 mL를 주입 후, AHA 1,500 mg/l (대조군 : AHA 미주입), Urea 1,500 mg/l, Slurry 18 mL (Urease 1,500 mg/l 대응 : Slurry 활성도 실험 실시)를 각각 주입 후, 온도 25°C, pH는 7.0 ± 0.01로 고정 후 실험을 진행하였다.

모든 Batch test는 250 mL serum bottle을 이용, 혐기성 조건을 위해 이산화탄소 (CO₂, 99.999%) purging을 실시한 탈이온수 (DI water)를 주입하여 200 mL working volume으로 조정하였으며, 교반 기능이 있는 항온수조를 이용 150 rpm 교반을 실시하였다. 시료채취는 일정 시간 후 (0 h, 24 h, 48 h) 샘플링을 실시하여 NH₃ 농도 분석을 실시하였다. 실험은 2 배수로 진행하여 그 평균값을 계산하여 사용하였다.

(3) 분석방법 및 데이터 계산 방법

NH₃는 이온형태와 가스형태로 존재하므로, 이온형태의 NH₃는 용액 샘플링 후 50배 희석, 여과 후 Ion chromatography (Metrohm, IC-790C, Switzerland)로 분석을 실시하였다. 가스 NH₃는 이온 NH₃ 샘플링이 끝난 Serum bottle에 3 M HCl을 주입 후 위 아래로 교반 후 샘플링 후 50배 희석, 여과 후 Ion chromatography (Metrohm, IC-790C, Switzerland)로 분석을 실시하였다. 총 NH₃ 농도는 두 형태의 NH₃ 합으로 산정되었다. Urea로부터의 NH₃ 전환 효율은 식 (1)을 통해 계산되었다.

AHA의 NH₃ 발생 억제 효율은 AHA를 주입하지 않은 대조군 (Urease)의 NH₃ 전환 효율 대비 AHA를 주입한 시료의 NH₃ 전환 효율을 비교하였다. AHA의 NH₃ 발생억제효율은 식 (2)를 통해 계산되었다.

실험 중 NO₂^-, NO₃^-는 검출되지 않아 본 실험에서 총질소 (Total Nitrogen)은 NH₃와 유기성 질소 (Urea)의 합으로 산정하였으며, 유입 Urea의 Urease에 의해 전환된 NH₃와 잔존 Urea의 합으로 나타내어 질소의 물질수지를 산정하였다.

결과 및 고찰

1. 시간 경과에 따른 Urea 농도별 NH₃ 발생량 비교

일정 시간마다 (0, 2, 6, 12, 24, 48 h) 샘플링을 실시하였으며, Ion chromatography를 통해 분석을 실시하였다. 시간 경과에 따른 Urea 농도별 NH₃ 발생량 (mg/l)을 Table 1과 Figure 1에 나타내었다. 48시간 후 대조군에 비해 AHA 주입을 통한 Urease의 활성 저해로 인해 NH₃ 발생량이 감소한 것을 확인할 수 있었다 (Urea 750 mg/l : 391 mg/l→181 mg/l, Urea 1500 mg/l : 651 mg/l→197 mg/l, Urea 3000 mg/l : 1157 mg/l→243 mg/l)

Figure 1.

Comparison of NH₃ generation between the control group and AHA injection group.

2. Urea 농도 변화에 따른 Urease 활성 저해 효율 평가

식 (1), 식 (2)를 통해 산정된 Urea로부터의 NH₃ 전환율 및 AHA 주입에 따른 NH₃ 발생 억제효율은 다음과 같았다 (Table 2 및 Figure 2). 대조군 및 처리군 모두 Urea 농도가 증가할수록 NH₃ 발생량은 증가하였으나 {Con 391.4 ± 19.0 mg/l (Urea 750 mg/l → 1157.0 mg/l (Urea 3,000 mg/l), AHA 180.8 ± 19.4 mg/l (750 mg/l)→, 243.4 ± 25.0 mg/l (Urea 3,000 mg/l)}, 대조군의 NH₃ 전환율은 92.2 ± 4.5% (Urea 500 mg/l)에서 68.1 ± 0.5% (Urea 3,000 mg/l) 감소하였고, 처리군의 경우도 NH₃ 전환율은 42.6 ± 4.6% (Urea 500 mg/l)에서 14.3 ± 1.5% (Urea 3,000 mg/l)로 감소됨을 확인하였다. 이에 따른 NH₃ 발생 억제 효율은 53.8 ± 2.7% (Urea 500 mg/l)에서 79.0 ± 2.0% (Urea 3,000 mg/l)로 증가함을 확인하였는데, 이는 기질 효소 반응의 원리에 의해 기질의 양은 증가하는데 반해 효소의 양은 일정하게 유지되어 기질-효소중합체의 생성양이 제한되었기 때문으로 판단된다.

Figure 2.

NH₃ conversion efficiency and NH₃ generation inhibition efficiency by different Urea concentrations.

3. AHA 주입 농도 변화에 따른 Urease 활성 저해 효율 평가

반응시간 48 시간 경과 후의 AHA 주입 농도 변화에 따른 Total NH₃ 발생량 및 전환율, NH₃ 발생 억제효율을 식 (1), (2)를 이용해 계산하여 Table 3과 Figure 3에 나타냈다. 대조군의 NH₃ 발생량은 709.3 ± 84.2 mg/l, 전환율은 83.5 ± 9.9%로 분석되었고, AHA 주입 농도 별 NH₃ 발생량은 259.7 ± 35.8 mg/l (AHA 500 mg/l)→118.9 ± 14.1 mg/l로 감소함을 확인하였고, NH₃ 전환율 또한 30.6 ± 4.2%→14.0 ± 1.7%로 감소되었다. 이에 따른 NH₃ 발생 억제효율은 63.4 ± 0.8%→83.2 ± 0.1%로 증가되었다. 이는 Urea 농도 별 결과와 마찬가지로 기질-효소 반응에서의 효소의 양이 제한된 원인으로 생각된다.

Figure 3.

NH₃ conversion efficiency and NH₃ generation inhibition efficiency by different AHA concentrations.

4. pH 변화에 따른 Urease 활성 저해 효율 평가

가축 분뇨는 저장기간이 길어짐에 따라 단백질의 혐기성 분해로 인해 암모니아 및 알칼리 유발물질 발생 및 축적으로 pH가 상승하는 것으로 알려져 있다 (Deviney and Victoria, 2018). 본 연구는 pH 변화에 (pH 6→10) 따른 AHA 주입 시 Urease 활성 저해 효율의 평가를 목적으로 하였다. 대조군의 pH 를 6→10 변화시켰을 시 NH₃ 전환율은 52.2 ± 0.5% (pH 6)→76.9 ± 1.5% (pH 10)로 증가함을 확인하였다. AHA 주입 시 NH₃ 전환율은 10.9 ± 0.2% (pH 6)→21.3 ± 0.7% (pH 10)로 나타났으며, 대조군에 비해 상대적으로 낮은 NH₃ 증가를 확인하였다. NH₃ 발생 억제효율은 79.1 ± 0.1% (pH 6)→72.3 ± 0.3% (pH 10)로 감소되었다 (Table 4, Figure 4).

일반적으로 효소의 활성은 pH의 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 본 실험 결과를 바탕으로 분뇨의 장기간 저장 시 Urease 활성 저해 효율의 감소가 예상되므로 이에 따른 대책이 요구될 것으로 판단된다.

Figure 4.

Effect of AHA injections on NH₃ conversion efficiency and NH₃ generation inhibition efficiency from urea at different pHs (pH 6-10).

5. 온도 변화에 따른 Urease 활성 저해 효율 평가

Urease 효소의 활성은 pH와 더불어 온도의 영향을 크게 받을 수 있기 때문에 본 연구는 계절별 축사의 온도 변화를 고려하여 15°C→35°C에서의 AHA 주입 시 Urease 활성 저해 효율의 변화를 관찰하였다 (Table 5, Figure 5). 온도를 15°C→35°C로 변화 시 대조군의 NH₃ 발생량은 478.4 ± 8.0 mg/l (15°C)→578.4 ± 9.1 mg/l (35°C)로 증가하였다. 대조군의 NH₃ 전환율은 56.3 ± 0.7% (15°C)→68.1 ± 0.8% (35°C)로 산정되었다. AHA 주입 시 NH₃ 전환율은 8.1 ± 0.3% (15°C)→25.7 ± 0.7% (35°C)로 온도 상승에 따른 NH₃ 증가를 확인하였다. NH₃ 발생 억제효율은 85.5 ± 0.4% (15°C)→62.3 ± 0.1% (35°C)로 pH에 비해 소폭 감소함을 확인하였다.

우리나라는 계절의 변화가 뚜렷하므로, 계절별 축사 온도를 고려하여 주입량 변화 등의 대응이 필요할 것으로 보인다.

Figure 5.

Effect of AHA injections on NH₃ conversion efficiency and NH₃ generation inhibition efficiency from urea at different temperatures (15 ℃-35 ℃).

6. 돈분뇨 내 AHA 적용 시 NH₃ 발생 저감 확인

앞선 실험과 달리 본 실험은 실제 돈분뇨 내 AHA 주입 시 Urease 활성 저해 및 NH₃ 발생 저감 가능성 확인을 위해 합성분뇨 (Urea+Jack bean urease)와 비교 실험을 실시하였다. 우선 돈분뇨 내 Urease의 활성도 측정을 위해 돈분뇨 주입량의 차이를 두어 NH₃ 발생량을 확인하였다 (Table 6).

기존 실험에 사용된 Jack bean urease 1,500 mg/l에 해당하는 활성도를 얻기 위해 주입되어야 할 돈분뇨 양은 약 18 mL로 산정되었다.

실제 돈분뇨 (Slurry+Urea) 및 합성분뇨 (Jack bean urease+Urea) 내 AHA 적용 시 NH₃ 발생량 및 전환율, NH₃ 발생 억제 효율을 Table 7, Figure 6에 나타내었다.

AHA 주입하지 않은 대조군 Slurry+Urea의 NH₃ 발생량 및 전환율은 591.8 ± 10.8 mg/l, 69.7 ± 1.3 (%), 다른 대조군인 Jack bean urease+Urea의 경우 NH₃ 발생량 및 전환율은 567.0 ± 9.2 mg/l, 66.8 ± 1.1 (%)로 각각 나타났으며, Slurry+Urea 내 AHA 주입 시 NH₃ 발생량 및 전환율은 158.3 ± 6.4 mg/l, 18.6 ± 0.8 (%), Jack bean urease+Urea 내 AHA 주입 시 NH₃ 발생량 및 전환율은 141.1 ± 3.8 mg/l, 16.6 ± 0.4 (%)로 확인되었다. AHA 주입에 따른 NH₃ 발생 억제 효율은 73.3 ± 0.6% (Slurry+Urea), 75.1 ± 1.1% (Jack bean urease+Urea)의 결과를 보여, 합성분뇨 및 실제 분뇨 내 AHA의 적용은 별다른 차이 없이 Urease 활성을 저해하여 NH₃ 발생을 저감하는 것을 확인할 수 있었다.

Figure 6.

Comparison of NH₃ conversion efficiency and generation inhibition efficiency upon AHA injection in synthetic urease and actual swine slurry.

결 론

본 연구는 AHA 적용을 통한 가축분뇨 내 Urea로부터의 NH₃ 전환되는 과정에서 관여하는 Urease의 활성 저해를 목표로 하였고, 이에 따른 가축분뇨 저장과정에서의 NH₃ 발생 저감 가능성을 확인하였다. Urea 농도 및 AHA 농도와의 Urease 활성 저해 효율의 비례관계를 확인하였고, pH 및 온도 상승 시에는 Urease 활성 저해 효율이 감소되었다. 또한 실제 분뇨 내 AHA 적용을 통해 Urease 활성 저해 및 NH₃ 발생 저감을 확인하였다.

축사 내 가축분뇨의 저장 장기화및 축사의 계절별 온도 변화에 의한 Urease의 활성 저해 효율에 민감하게 영향을 미칠 것으로 예상되며, 이에 따른 AHA 주입량 최적화 등의 대책이 강구되어야 할 것이다. 다양한 Urease inhibitor와의 혼합 등 경제성과 효과 지속성을 고려한 주입 조건 도출 등의 연구가 필요할 것으로 판단된다.